細胞實驗是上海達為科生物的基礎服務項目之一，由細胞平臺經驗豐富的實驗人員操作完成。
一.細胞增殖實驗
1. MTT法:是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟、快捷。原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚( Formazan )并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜( DMSO )能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值,可間接反 映活細胞數量。在一定細胞數范圍內, MTT結晶形成的量與細胞數成正比。
2. CCK-8法:可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析,常用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。原理:該試劑中含有WST-8 [化學名: 2-(2-甲氧基4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽], 它在電子載體1-甲氧基 -5-甲基吩嗪諭硫酸_二甲酯( 1-Methoxy PMS )的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物( Formazan dye )。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
3. Brdu:即5- Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期, S期活體注射或細胞培養加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物雙重染色可判斷增殖細胞的種類,增殖速度,對研究細胞動力學有重要意義。但由于抗體分子量大,難于摻入并被有效檢測。因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCI或加熱使DNA變性。這些處理方法會破壞抗原識別位點,此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNAD這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。
4. EDU:即5-Ethynyl-2' - deoxyuridine,是-種胸腺嘧啶核苷類似物,能夠在細胞增殖時期
代替胸腺嘧啶(T )滲入正在復制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA復制活性,適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA修復、病毒復制、細胞標記示蹤等方面的研究,尤其適合進行siRNA、miRNA、 小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。
二、細胞凋亡
ANNEXIN V-PI法:在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸( PS )只分布在細胞膜脂質雙層的內側,而在細胞凋亡早期,細胞膜中的磷脂酰絲氨酸( PS )由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35~ 36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之- -。將Annexin V進行熒光素( EGFP、FITC )標記,以標記了的Annexin V作為熒光探針,利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶( Propidium Iodide, PI) 是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但對凋亡中晚期的細胞和死細胞, PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。
三、細胞遷移和侵襲
1. Transwell :是一種侵襲實驗技術,其實原理簡單地說就是用一層膜將高營養的培養液和低營養的培養液隔開,細胞放在低營養的培養液里,為了找吃的,細胞會往高營養的培養液里面跑,但是有膜擋著,所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上- -層基質膠,模仿細胞外基質,于是細胞要把基質消化了才可以從低營養的培養液跑到高營養的培養液里面,后我們檢測高營養的培養液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了。
2.劃痕實驗:是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法,類似體外傷口愈合模型,在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上,用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線,去除中央部分的細胞,然后繼續培養細胞至實驗設定的時間(例如72h),取出細胞培養板,觀察周邊細胞是否生長(修復)至中央劃痕區,以此判斷細胞是否生長(修復)至中央劃痕區,以此判斷細胞的生長遷移能力, 實驗通常需設定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別,通過不同分組之間的細胞對于劃痕區的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。
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